CRISPR-Cas9 potrebbe causare centinaia di mutazioni non previste

Quando si parla di CRISPR-Cas9, il rivoluzionario sistema di editing genetico, gli aggettivi che immancabilmente si usano per descriverlo sono due: economico e preciso. Sono senza dubbio appropriati, ma vanno inquadrati nel giusto contesto.

Ad esempio, un nuovo studio pubblicato su Nature Methods ha dimostrato che, quando viene applicato sui topi per riparare un gene difettoso, CRISPR-Cas9 può causare centinaia di mutazioni non previste da questi algoritmi. Prima di allarmarci, però, facciamo un passo indietro. Certo, potete portarvi a casa un kit CRISPR-Cas9 con circa 300 dollari, purché casa vostra sia un laboratorio di biologia molecolare attrezzato con gli altri centomila dollari di strumenti base necessari per poterci fare qualcosa di utile. Come sintetizzare metanfetamine con il piccolo chimico è piuttosto improbabile, allo stesso modo, i kit "domestici" per CRISPR da 150 dollari sono più o meno giocattoloni. Ciò non toglie che stiamo comunque parlando di una tecnica meno costosa di due o tre ordini di grandezza rispetto a quelle predecenti, quindi economico è un aggettivo che va benissimo. Passiamo ad esaminare il secondo aggettivo: CRISPR-Cas9 è la tecnica di modifica genetica più precisa mai sviluppata, permettendo modifiche a livello di singola lettera nel DNA. Dagli anni Settanta, il sogno dei biotecnologi è la terapia genica — ovvero, riparare mutazioni che rendono difettosi i geni di un paziente per curare le più disparate e finora incurabili malattie genetiche. E uno tra i molti ostacoli che rendeva le terapie geniche incredibilmente costose e difficili da sperimentare sull'uomo era l'imprecisione dei vecchi strumenti. Ma solo dall'inizio del 2017 sono già state annunciate 20 nuove sperimentazioni cliniche per terapia genica basata su CRISPR.

Più preciso di qualsiasi altra tecnica, però, non significa necessariamente abbastanza preciso per l'uso clinico.

Le "forbici molecolari" riconoscono il punto da tagliare utilizzando un RNA guida come se fosse uno stampo: le basi nel DNA vengono confrontate una ad una e le modifiche vengono effettuate solo nei punti in cui si trova una corrispondenza. Lo stampo riconosce una sequenza lunga 22 lettere, un numero consistente: essendoci 4 possibilità in ogni posto, una sequenza completamente casuale potrebbe ripetersi circa ogni ventimila miliardi di basi.

Siccome il genoma umano ha un corredo di 3 miliardi di paia di basi, con questo ragionamento ingenuo potrebbe sembrare che non ci sia rischio che la nostra forbice incontri per caso sequenze uguali a quella che stiamo cercando. Ma le lettere nel genoma umano non sono casuali, e i processi evolutivi che hanno scolpito i nostri geni fanno sì che alcune sequenze di 22 lettere siano introvabili, mentre altre sono ripetute frequentemente. Non solo: a volte Cas9 taglia un bersaglio anche se combaciano solo 17 o 18 delle 22 basi, a causa di ciò, il numero delle sequenze sinonime possibili aumenta. Questi tagli "indesiderati" vengono chiamati effetti "off-target" — fuori bersaglio — e siccome dipendono dalla specifica sequenza che si vuole tagliare, possono essere più o meno frequenti a seconda di quale gene si voglia editare. Quindi, quando si progetta l'RNA guida per un esperimento, si usano programmi che prevedono i possibili effetti off target e, nel caso questi siano troppi o troppo rischiosi, si utilizzano varie strategie per cercare di ridurli.

I ricercatori dello studio uscito su Nature Methods intitolato "Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo" sono riusciti a riparare il gene Pde6b nella cellule della retina di topini nati ciechi, ridando loro la vista. Hanno poi sequenziato completamente il loro genoma, andando a confrontare tutte le differenze tra i topi che hanno subito il trattamento rispetto ad altri dello stesso ceppo, che dovrebbero essere quasi identici dal punto di vista genetico.

Sebbene i topi curati con CRISPR-Cas9 fossero a prima vista totalmente sani, dopo la terapia genica, i ricercatori hanno trovato nel loro genoma quasi 1500 mutazioni non previste, tra cui 100 inserzioni o delezioni (una lettera aggiunta o mancante) — 5 di queste sono considerate potenzialmente deleterie. Questa quantità di mutazioni supera di circa 10 volte il numero di nuove mutazioni che compaiono in ogni generazione nell'uomo, ovvero, quelle che non avete ereditato dai vostri genitori ma che sono unicamente vostre.

Questo articolo contraddice un precedente studio dell'Università di Cambridge, pubblicato sempre su Nature Methods, in cui si mostrava che le mutazioni in topi modificati con CRISPR erano rare perché include anche tutte le variazioni, anche sinonime, sulle singole basi, e non solo quelle nelle regioni codificanti. Normalmente, queste mutazioni sono silenziose e neutrali, ma molto spesso sono piccole parti individuali di tratti genetici complessi che possono avere conseguenze anche significative per la salute.

Il nuovo studio si focalizza su uno specifico RNA guida per un preciso gene bersaglio, e quindi non è chiaro quanto sia generalizzabile il risultato. Tuttavia, mostra l'importanza di verificare in vivo — e non solo in vitro o in silico — gli effetti off target sul genoma completo, specialmente prima di passare in clinica e alla sperimentazione sull'uomo.

Gli autori dello studio invitano inoltre a pensare alla terapia genica con CRISPR-Cas9 come a qualsiasi altra terapia medica, in termini di bilancio tra rischi e benefici, effetti positivi e potenziali effetti indesiderati, e a valutare le applicazioni in base al gene bersaglio e al genoma individuale.